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- 生物表面活性剂Surfactin生产菌株的定向改造策略
- 发布日期：2025-01-04 16:40 点击次数：203
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脂肽(lipopeptides)是由微生物产生的一类生物表面活性剂(biosurfactant)，由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成，按其结构特征大致可分为环状脂肽(cyclic lipopeptides，CLPs)与线性脂肽两类。表面活性素(surfactins)是芽胞杆菌合成的环脂肽类主要家族之一，其余还包括伊枯草菌素(iturins)家族、丰原素(fengycins，芬介素)家族等[1]。 Surfactin由日本学者Arima在枯草杆菌Bacillus subtilis IFO3039发酵液中首次发现，是迄今已报道的表面活性最好的生物表面活性剂之一[2]；在0.005%浓度下，能将纯水的表面张力从72 mN/m降到27.9 mN/m。相比于化学类表面活性剂，surfactin具有低毒、易生物降解、较高的环境适应性和较高的表面活性等优点，在农业、医药和日化等领域具有非常良好的应用前景[3]。在微生物采油和污染物治理等环境领域，生物表面活性剂surfactin有助于石油烃的乳化增溶，可以作为微生物降解原油的增效剂[4]。然而，surfactin的发酵生产存在产量低和成本高等问题，阻碍了其产业化及大规模应用。目前，除了采用传统的诱变育种及发酵工艺优化等手段外，一些利用基因工程定向改造surfactin生产菌株的策略也应运而生。本文对surfactin的结构特点、合成机理及应用特性进行简述，并对目前面向surfactin的结构改造和产量提高的策略进行了总结，以期为推动surfactin的产业化提供参考。 1 Surfactin的结构特点与合成机理
Surfactin的亲水基团(极性基团)是由7个氨基酸组成的肽环，包含2个酸性氨基酸(Glu、Asp)和5个非极性氨基酸；疏水性基团(非极性基团)是由13–15个碳原子链长的β-羟基脂肪酸构成；肽骨架7位氨基酸的羧基与脂肪酸的β-羟基形成内酯键，构成环状脂肽(图 1)[5]。由于脂肪酸链的长度以及氨基酸的种类和位置的改变，使得surfactin具有许多同系物(congeners)或异构体(isoforms)。
Surfactin是少数具有较明确研究背景的脂肽化合物，由非核糖体肽合成酶系(nonribosomal peptide synthetases，NRPS)的多酶复合体系催化完成。用于合成surfactin的NRPS是一个多酶复合物，包括Srf-AA-AB-AC-AD四个亚基，由srfA基因簇上的4个基因(srfAA、srfAB、srfAC和srfAD)编码[6-7]。亚基SrfAA和SrfAB各包含3个模块，SrfAC亚基包含1个模块；每一个模块负责1个氨基酸的整合，氨基酸的排列顺序就由模块的顺序决定。最后，由硫酯酶(thioesterase，TE；由srfAD编码)结构域负责催化环合聚肽链。整个合成过程可被分解为4个部分，即合成的启动、合成的起始、肽链的延伸以及环化。NRPS催化的surfactin合成过程如图 2所示。SrfAA中的3个模块按顺序分别负责组装L-Glu、L-Leu和D-Leu (第3个模块通过差向异构化酶作用将底物L-Lue转换成D-Lue)；SrfAB的3个模块按顺序组装L-Val、L-Asp和D-Leu(差向异构酶同SrfAA中的差向异构酶相同)；SrfAC负责组装剩下的L-Leu残基，由硫酯酶结构域TE催化第7位的L-Lue的羧基与长链脂肪酸的β羟基形成内酯环，并将其释放[8]。
2 提升Surfactin产量的定向改造技术
从各种环境中分离的产surfactin野生菌株的产量通常在100–600 mg/L[9-11]；部分高产突变菌株或培养基优化后的菌株发酵水平在1000 mg/L左右[12-13]；此后，仅通过诱变育种或发酵优化的传统策略已经难以获得产量的大幅突破。 在提升surfactin产量的菌株改造方面，针对NRPS功能基因srfA的启动子改造和强化surfactin外排分泌途径的改造策略，获得了较好的成果，对surfactin产量的提升效果达到了3–10倍(表 1)。
2.1 NRPS功能基因srfA的启动子改造
SrfA是surfactin合成的功能基因，是一个长达26.2 kb大小的基因簇，因此，通过过表达该基因来强化surfactin的合成途径在技术上存在较大难度。该功能基因受到启动子PsrfA的调控，而启动子的强弱可以在一定程度上决定菌株的生产能力，因此，启动子替换被认为是提高原始菌株产脂肽的合理手段。 启动子改造促进产量提升的典型成功案例来自于对天然高产菌株的改造结果。Sun等[14]通过同源重组的方法将B. subtilis fmbR中的启动子PsrfA替换成一个来源于B. subtilis的强诱导型启动子Pspac，得到了重组菌株fmbR-1；在IPTG (300 μmol/L)诱导下重组菌株fmbR-1的产量是野生型出发菌株的10倍，产量达到3.86 g/L；在无IPTG添加条件下，fmbR-1的产量也可以高达5倍左右。除了替换一些天然强启动子外，还可以替换一些人工合成的启动子。清华大学于慧敏课题组在surfactin的启动子改造方面也获得了显著成果。Song等[11]分析了surfactin高产野生菌株B. subtilis THY-7的转录组数据，发现该菌株控制surfactin合成的原始启动子PsfrA是一个弱启动子，同时也发现了菌株自身的一些强启动子(PgroE、PsacB、PsacP)；令人惊讶的是用强启动子PgroE替换原始启动子PsfrA后，重组菌株不能合成surfactin；随后人工构建了3个杂合型强启动子Pg1、Pg2和Pg3用于改造B. subtilis THY-7菌株。杂合型启动子Pg1融合了启动子PgroE的–35到–10序列和PsacB的RAT诱导元件序列，重组菌株THY-7/Pg1的产量达到了1.44 g/L。杂合型启动子Pg2是在Pg1的基础上，在PgroE的–35到–10序列中间融合了一段lacO操纵子序列，重组菌株THY-7/Pg2的产量为5.98 g/L。杂合型启动子Pg3是根据枯草芽胞杆菌的sigma因子70(σA)的–35到–10的保守序列以及点突变Pg2的2个碱基的基础上设计而来的，最终重组菌株THY-7/Pg3在5 L发酵罐上(具有泡沫回收装置)发酵32 h的产量达到了9.74 g/L，表明改造后的菌株具有高产、高生产速率等优良性状。该重组菌株的surfactin产量也是目前报道的最高产量。 但是，在模式菌株或其他菌株中也存在启动子改造的失败案例。Coutte等[15]用组成型启动子PrepU替换了B. subtilis 168衍生菌株BBG111的PsrfA后，得到突变菌株BBG113的surfactin产量却有所下降。随后Wilenbacher等[16]的研究发现，用一个强的组成型启动子Pveg分别替换产surfactin能力弱的菌株3A3B和产surfactin能力强的DSM 10T的原始启动子PsrfA，产生重组菌JWSurf2和JWSurf3；结果发现重组菌JWSurf2的surfactin产量高于原始菌3A3B，而JWSurf3的产量却远低于原始菌DSM 10T。 由此我们可知，通过定向改造产surfatin菌株的启动子PsrfA并不都会导致surfactin产量的提高，这可能与菌株自身产surfactin能力的强弱以及菌株特性有关。对野生型surfactin生产菌株进行启动子改造前，有必要对菌株的转录组进行分析，有针对性地改造或构建适合该菌株的强启动子或杂合启动子，有助于提高成功率。同时，也要考虑到野生芽胞杆菌的遗传操作系统存在很多不确定性，大大增加了分子改造的难度；选择和构建合适的遗传操作方法是成功的基础。 2.2 Surfactin外排分泌途径的改造
目前，surfactin是如何通过细胞膜排出体外的并不是十分清楚。脂肽特别是surfactin可以增加生物膜的透性和解离程度，使生物膜结构失去稳定性。据文献报道surfactin的浓度对细胞膜的影响十分关键，surfactin的外排可能就是跨膜运输的结果；跨膜运输按所用能量不同，可以分为两类：一类是依赖于ATP，另一类是依靠质子动力(proton motive force，PMF)[21]。 Surfactin的分泌受到一些外排蛋白的影响。Tsuge等[22]报道了枯草芽胞杆菌中的跨膜蛋白编码基因yerP可以编码与RNDRND(抗性，结瘤和细胞分裂)家族外排泵同源的依赖于PMF的跨膜蛋白；该基因有助于枯草芽胞杆菌抵御surfactin对自身细胞的伤害，与野生型相比，yerP缺失型菌株的surfactin产量大大减少。Xu等[13]报道B. subtilis THY-7野生菌中surfactin的外排模式主要依赖于质子动力(PMF)，而THY-7菌株中的跨膜蛋白基因ycxA由于移码突变造成功能丧失，不能转运surfactin。因此，他们在THY-7菌株中分别表达了3个PMF驱动的跨膜蛋白编码基因ycxA、krsE和yerP，结果发现与THY-7菌株相比，强化surfactin外排途径的重组菌株产量分别提高了89%、52%和145%。对于菌株的外排系统的改造，首先要知道该菌株外排的方式以及外排性能的优劣，通过强化表达的方式来增加细胞中参与surfactin外排的跨膜蛋白，对于这些外排蛋白是如何促进surfactin流通的机理仍需进一步的研究。 2.3 改造srfA的转录调控基因
Surfactin的合成需要功能基因簇srfA的转录表达；但是特别之处在于，基因簇srfA中(srfAB)还包含了感受态调控基因comS，使得功能基因srfA的转录水平受到信息素ComX和感受态刺激因子Phr的调控。人们推测surfactin与细胞感受态之间的关联性，可能在于surfactin改变膜结构有助于吸收外源DNA片段[17]。 B. subtilis编码了8个Phr感受态刺激因子(PhrA、PhrC、PhrE、PhrF、PhrG、PhrH、PhrI和PhrK)和11个天冬氨酰磷酸酯磷酸酶蛋白(RapA到RapK)。Phr刺激因子可以抑制对srfA负调控的Rap蛋白(RapC，RapF和RapK)的活性。ComX与膜结合的组氨酸激酶ComP相互作用，其在受到刺激后自磷酸化，然后将其磷酸基团转移到调控蛋白ComA中的丝氨酸残基，磷酸化的ComA与srfA的启动子区域结合，激活RNA聚合酶的活力，使srfA开始转录。因此，B. subtilis通过信息素和刺激因子ComX和PhrC基于细胞群体感应机制(quorum sensing，QS)调控surfactin合成[18]。Jung等[19]在B. subtilis中过表达comX和phrC基因，得到重组菌B. subtilis(pHT43-comXphrC)的surfactin产量大幅提高，是对照菌株的6.7倍。Wang等[20]突变了B. subtilis的ComX反应调节受体基序中的3个非天冬氨酸残基，结果使surfactin的合成能力大大下降。 细胞群体感应贯穿了surfactin合成的整个过程，ComX似乎是提高surfactin生产能力的一个关键因素，然而，对于该基因调控网络的研究并不多。目前，有关QS调控基因与surfactin合成能力的研究中所使用菌株的生产能力普遍较低，我们还无法了解在高产菌株中这些QS调控基因及其调控方式是否有改变。 3 改造Surfactin分子结构的组合生物合成技术
组合生物合成技术(combinatorial biosynthesis)，即通过基因工程技术，有目的地改变天然产物的生物合成途径，形成可预测的新结构产物[23]。组合生物合成技术在环脂肽类抗生素结构改造中发挥了重要作用，这些人为产生的新结构化合物按照研究者的预期表现出新的功能或活性。 3.1 合成具有不同肽环模块的surfactin新结构分子
非核糖体肽合酶的组合生物合成研究策略包括模块定点突变、替换、插入、删除、模块“洗牌”等。Koglin等[24]通过对surfactin合成酶系NRPS蛋白晶体结构的解析及分子模拟的研究，逐渐阐明了各个功能模块存在选择特异性的原因。经过大量的序列比对和同源建模分析，研究者总结出决定腺苷结构域(A domain)底物选择性的“密码子”——10个氨基酸残基，为定点突变提供了经验指导，这样就可以将NRPS特定位置的氨基酸突变为其他氨基酸。例如：通过定点突变技术，将模块C-AGlu-PCP中的Lys239突变为Gln239；生化分析和发酵产物显示，该模块腺苷结构域的识别氨基酸由Glu变为Gln；此外，识别Asp的腺苷结构域也可以突变成识别Asn，由此策略，研究者获得了数个surfactin的结构类似物[25]。还有研究学者通过对NRPS的改造，使得模块能对带有特别功能团的非天然氨基酸进行识别和活化。如针对识别苯丙氨酸的腺苷化结构域的突变和改造，使得识别底物拓展为带有叠氮或炔烃官能团的非天然芳香族氨基酸，从而使得以叠氮-炔基Husigen环加成反应为代表的“点击化学”(click chemistry)极大地丰富了肽模块的多样性[26]。 通过基因工程的手段将目标腺苷结构域进行无义突变，这样合成的肽链上就缺失了特定氨基酸。比如，在保证读码框不变的情况下，研究者将surfactin基因簇模块2缺失，获得一个相应位置Leu缺失的缩环产物，即六肽surfactin新分子。六肽surfactin对红细胞的毒性降低，抑菌能力增强；但由于自身结构的不稳定等原因导致了六肽surfactin产量只有野生菌株的5%–10%，发酵浓度仅25–50 mg/L[27]。NRPS的模块删除还可以做到极致，即仅保留谷氨酸作为亲水基团，形成产物为β-羟基脂酰谷氨酸(FA-Glu)，已有的研究表明，新化合物FA-Glu较商业化表面活性剂肉豆蔻酰谷氨酸具有更低的临界胶束浓度(CMC)和更高的水溶性[28]。但是FA-Glu的产量仍较低，是野生型菌株surfactin产量的15%左右，发酵浓度仅200–250 mg/L[29]。Jiang等[30]用温敏型质粒分别敲除了B. subtilis PB2-L1中的产surfactin的NRPS模块SrfAA-Leu、SrfAB-Asp和SrfAB-Leu，结果产生了3种六肽结构的surfactin新化合物，分别缺少Leu-3、Asp-5和Leu-6；与原来的surfactin相比，前两者可以减少毒性，后者具有更强的抗真菌活性，但新结构surfactin产物的积累浓度极低，只有0.82–1.35 mg/L。 组合生物合成技术在开发surfactin新结构及拓展其应用方面，既存在机遇也存在挑战。改造NRPS区域可以产生具有新活性的新型结构分子，但是NRPS结构复杂性远远超出人们的想象，模块的完整性、链接区多样化导致了人们的实际操作过程并不理想。通过基因改造策略实现生物合成基因簇突变后，经常不生产结构类似物，或者改造过的NRPS催化效率大大降低、产量大大减少。 3.2 Surfactin中脂酰基结构的改造
相比于已经深入研究的NRPS催化surfactin肽环结构的合成，surfactin分子中脂酰基结构的合成途径研究则显得很单薄。Surfactin中脂肪链的长度一般为C13–C15，通常以C14和C15组分为主(60%–80%)，脂肪酸组分的结构差异也会对物理化学性质和生物活性产生显著的影响。在抗真菌活性和表面活性方面，构型性能为straight(n)强于iso强于anteiso；在发泡能力方面C14-surfactin强于C13和C15[31]。随着surfactin脂肪链长度的增加，其表界面活性显著增强[32]。甚至，surfactin脂肪酸组分比surfactin总产量对表面活性的影响作用更大，iso-奇数脂肪酸异构体比n-偶数脂肪酸异构体具有更高的排油圈活力[33]。本课题组的研究表明surfactin在同等工作浓度下，C15-surfactin组分含量越高，其油砂清洗效率和原油驱替效率越高[34]。因此，在对surfactin的结构多样性研究中，定向改造或强化特定碳链组分的surfactin产物对于促进surfactin的应用同样具有重要意义。 糖脂类生物表面活性剂如鼠李糖脂或槐糖脂，其疏水结构也都是中长链的脂肪酸；糖脂的疏水结构脂酰基链长及不饱和度与菌株特性有关，也与发酵原料有关，糖脂的优势发酵底物通常是油脂或脂肪酸[35-36]。但是，向培养基中添加油脂或游离脂肪酸并不能促进surfactin合成，反而起抑制作用[37]，这也使得我们推测surfactin中的脂肪酸结构可能来源于从头合成途径。 有关surfactin脂肪酸结构的早期研究是通过改变培养基中氨基酸组分来实现，如在B. subtilis T89-42菌株的培养基中添加Arg、Gln或Val可以增加偶数β-羟基脂肪酸组分(C14, C16)，而添加Cys、His、Ile、Leu、Met、Ser或Thr可以增加奇数β-羟基脂肪酸组分(C13, C15)[38]。此后，人们通过改造或强化某些氨基酸合成途径，也引起了surfactin产物的脂肪酸组分变化。Coutte等[39]通过强化L-Leu的代谢途径，使得B. subtilis 168衍生菌株中surfactin产量提高了1.6–20.9倍；其中，敲除codY基因以后，不仅让surfactin的产量达到最高，还使得surfactin的结构组分发生了变化：对照菌株中C13和C14的组分分别是39.7%和21.2%，而敲除了codY以后的比例分别为26.5%和40.6%。后来，Coutte等[31]在研究支链氨基酸代谢途径时发现，在敲除了负责支链氨基酸最后一步降解的基因lpdV后，带有直链C14的surfactin比例提高了2.5倍。 显然，利用外源添加氨基酸组分或内部改造氨基酸合成途径还难以实现对surfactin脂肪酸结构的定向控制；针对脂肪酸结构的改造，还需要深入理解surfactin的底物3-羟基脂肪酸如何参与NRPS的合成启动。Steller等[40]的研究表明，在surfactin的合成起始步骤中，底物3-羟基脂肪酸在脂酰CoA连接酶(fatty acyl CoA ligases，FACLs)作用下与辅酶A (CoA)结合后，以3-羟基脂酰CoA的激活形式参与第一个氨基酸Glu的酰化作用。他们对枯草芽胞杆菌中4个FACLs (LcfA、YhfL、YhfT和Yngl)进行敲除实验发现，单一敲除只能导致surfactin的产量降低38%–55%，同时敲除2–3个基因时surfactin产量约为20%–65%，同时敲除4个基因时产量下降了84%。这一结果表明surfactin合成途径中，催化脂肪酸形成脂酰CoA激活形式的FACLs可能存在多个基因或多个同工酶。 NRPS的合成起始模块srfA-A1的C domain对底物脂肪酰CoA的选择性对于surfactin合成的起始更为重要。Kraas等[40]采用3-羟基肉豆蔻脂酰CoA、棕榈脂酰CoA、癸脂酰CoA、3-羟基丁脂酰CoA为surfactin合成起始模块的供体，结果表明C domain选择3-羟基肉豆蔻酰CoA为底物进行酰化反应，不催化没有羟基化的脂肪酰CoA进行酰化反应。这一结果表明NRPS合成起始模块srfA-A1的C domain有可能成为脂肪酰结构改造的重要靶标，通过解析合成起始模块srfA-A1中C domain的底物选择性机制，就有可能进一步通过突变来获得能催化特殊结构脂酰基底物的起始模块。 总之，相比已经深入研究的NRPS催化的surfactin肽环结构，其脂肪酸结构组分的合成及调控机制还存在很多未知区域；获得特定脂酰基结构的surfactin新化合物仍然没有很好的解决方案。我们推测通过强化脂肪酸的从头合成途径，改造脂酰CoA连接酶FACLs和合成起始模块C domain的底物选择性，有望创造或强化特定脂酰结构的surfactin组分。 4 前景展望
Surfactin由于具有多种生物活性，使其在基础研究和工业应用领域受到广泛重视，但是当前的surfactin发酵工艺及成本控制方面仍不能满足工业应用的需求。在发酵工艺方面，控制发酵过程中产生的泡沫仍然是未来研究中的挑战，亟需从工艺及装备等多个方面来解决surfactin由于表面活性带来的发酵液泡沫溢出及营养液流失等问题[41]。此外，寻找廉价的生物质原料也是降低发酵成本、促进surfactin工业化应用的有效手段。如本课题组利用富含木糖的玉米芯酸解液和富含氨基酸的羽毛酸解废液、味精废液等廉价有机氮源发酵制备surfactin，不仅降低了原料成本，还促进了农业废弃物的资源化利用[42]。 在生产菌株方面，获得高产、高转化率和高生产速率的优良菌株是促进surfactin产业化的关键因素。其中，通过定向改造技术获得优良菌株或新结构化合物是推动surfactin产业化和拓展surfactin应用领域的关键技术。随着NRPS的结构解析以及组合生物合成技术在NRPS结构改造中的应用，定向改造脂肽surfactin的短肽部分获得了技术支撑；与之相比，surfactin的脂肪酰结构依然缺乏可定向调控的技术手段，分析surfactin结构中脂肪酸前体的从头合成途径及参与surfactin合成的方式，不但可以促进surfactin前体的合成并提升产量，也将有助于开发定向调控酯酰结构的surfactin新化合物。
